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用於檢測第一型登革病毒的抗原

刊登日期：2014/05/21

‧ 專利名稱	用於檢測第一型登革病毒的抗原
‧ 專利證書號	I 318982
‧ 專利權人	國立臺灣大學
‧ 專利國家 (申請日)	中華民國 (2006/12/21)

‧ 發明人/PI	吳漢忠 ,林欽塘 ,陳韻晶 ,
‧ 單位	口腔生物科學研究所
‧ 簡歷/Experience

技術摘要 / Our Technology：

本發明係關於一種用於檢測第一型登革病毒的胜肽抗原，該胜肽抗原可與被第一型登革病毒感染之人類血清抗體呈免疫陽性反應，但與未感染第一型登革病毒之人類血清抗體呈免疫陰性反應。藉由本發明之胜肽抗原及其抗原決定位，可利用於第一型登革病毒之檢測以及試劑、組套的開發，並作為與第二型登革病毒相區別的胜肽抗原標記。【創作特點】為能找出第一型登革病毒上具特異性的抗原以及抗原決定位，使能對該型病毒進行檢測、確認，甚至與其他血清型登革病毒相區別，本發明係運用融合瘤技術製備出對抗第一型登革病毒之中和性(neutralizing)單株抗體，同時藉由噬菌體顯現系統(phage display)，由隨機之噬菌體胜肽庫(phage－displayed random peptide library)中篩選出對第一型登革病毒具專一性之B細胞抗原決定位(epitope)。
本發明同時可藉由此所篩選出之胜肽抗原與抗原決定位，進一步利用於相關偵檢試劑、疫苗或是中和性單株抗體之開發等應用，俾使對登革熱之治療與診斷提供最佳之檢測、預防與協助。
基於上述之目的，本發明首先以第一型登革病毒為抗原，篩選並製備出對抗第一型登革病毒外套膜蛋白(E)之單株抗體，並由其中篩選出具中和性之單株抗體。此些中和性單株抗體，經西方墨點法分析後發現，其僅得辨認原態(native)外套膜蛋白，而無法辨認變性(denatured)之外套膜蛋白。之後，進一步藉由噬菌體胜肽庫，以噬菌體顯現篩選法(phage display biopanning)篩選出能夠與該中和性單株抗體相辨識結合之噬菌體株。將此些呈免疫陽性反應之噬菌體株分離出後，定序分析其胜肽序列，即篩選出本發明中包括如SEQ ID NO：1、2、3、4或5所示的胺基酸序列。SEQ ID NO：1~5之胺基酸序列經比對，並非DEN－1外套膜蛋白胜肽序列之一部分，且於胜肽資料庫中並未找到相同的序列，因此本發明所發現之胜肽序列係前所未見之新穎抗原胜肽。
噬菌體顯現方式係將隨機DNA片段選殖至噬菌體基因III上，則噬菌體增生表現時會同時將該段基因以胜肽表現於外套(capsid)蛋白III上。由於其所表現出胜肽係以自然之構型存在，因此除可顯現線型胜肽的序列特徵外，同時亦可顯現其構型上的特徵，此可增加抗原篩選之專一性與正確性。由於SEQ ID NO：1~5之胜肽序列與DEN－1外套膜蛋白胜肽序列中者並不相同，且由前述之西方墨點法結果可知中和性單株抗體僅得辨認原態外套膜蛋白，因此，SEQ ID NO：1~5之胜肽抗原應係一模仿(mimic)自然抗原之抗原，或是屬構型上相近(conformational)之抗原。
為確認前述呈免疫陽性之噬菌體株，其顯現胜肽係為中和性抗體所辨識之抗原決定位，本發明進一步利用噬菌體競爭抑制法(phage－competitive inhibition assay)，以免疫印漬法進行測試。結果顯示，中和性單株抗體與外套膜蛋白結合時，會受到免疫陽性噬菌體株(顯現如SEQ ID NO：1~3所示之胜肽)的競爭性抑制，因此可確認噬菌體株顯現胜肽SEQ ID NO：1~3即係中和性抗原決定位。
另一方面，本發明將免疫陽性之噬菌體株(顯現如SEQ ID NO：1與2所示之胜肽)與DEN－1患者、DEN－2患者以及正常人類血清反應後發現，該噬菌體株僅與DEN－1患者血清產生免疫陽性反應，而不與DEN－2患者血清與正常人類血清產生免疫反應。因此，本發明之胜肽抗原不但可作為DEN－1檢測之胜肽標記，亦可同時作為DEN－1與DEN－2分型之區別測試之用。
藉由所篩選出之胜肽抗原與抗原決定位，本發明同時提供一種檢測抗第一型登革病毒抗體之組套，包括：一附著物；一抗人類IgG抗體，該抗人類IgG抗體係附著於該附著物上；至少一種顯現包括SEQ ID NO：1或2所示胜肽之噬菌體株，或係為顯現SEQ ID NO：1或2所示胜肽之噬菌體株；以及一連接有標記之抗噬菌體抗體。此外，本發明亦提供一種檢測第一型登革病毒感染之方法，包括：(1)提供一抗人類IgG抗體，將該抗體附著連接於一附著物上；(2)提供測試者之血清，將該血清與該附著物相接觸；(3)加入至少一顯現包括SEQ ID NO：1或2所示胜肽之噬菌體株，或係為顯現SEQ ID NO：1或2所示胜肽之噬菌體株進行反應；(4)加入連接有標記之抗噬菌體抗體進行反應；以及(5)檢測該顯現之胜肽是否與該測試者血清抗體相結合，其若呈免疫陽性反應，則該測試者感染有第一型登革病毒，且未感染有第二型登革病毒。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

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